自闭症的生物化学系列
导言
Leo Kanner 图片出处：维基百科
自闭症(autism)，又称孤独症，是一类严重影响青少年身心健康的精神性疾病。这种疾病在1946年由美国医生Leo Kanner首先系统阐述，表现为社交沟通障碍、无法正常与人交流、语言发育迟缓或障碍并带有重复刻板行为[1]。一部分自闭症患者具备超乎常人的能力，例如机械记忆、数学、绘画、音乐等。在诸多影视作品如《雨人》中，呆板但有超常数学天才的哥哥就是一个经典的自闭症病人形象。这种疾病严重影响青少年的正常生长发育，患者常常无法进入正常的教育环境接受教育，以及因为古怪刻板行为遭受社会误解等。
近年来，世界各国对自闭症的重视程度急剧上升，医学界不断更新自闭症类的诊断标准，如The Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS)、The Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R)。遗憾的是，和诸多精神类疾病，如精神分裂、抑郁症及双向情感障碍等一样，对自闭症的诊断目前还只能依赖于临床医生的主观判断。尽管已经有较确凿的证据表明自闭症与遗传因素关系十分密切，遗传学家对自闭症数十年的研究发现，与自闭症有关的基因多达上百个，说明自闭症并不是单一基因致病的疾病。在对自闭症相关基因的研究中，有几类与自闭症关系密切的基因及其编码蛋白最初都是由生物化学家首先发现的，这些生物化学家进而从生物化学逐渐过渡到神经生物学研究领域，为自闭症的神经生物学研究做出了重要贡献。
在本连载中，笔者将尝试用通俗的笔法描述这些生物化学家发现自闭症相关蛋白质的过程，并且对这些自闭症相关蛋白质的最新研究进展做简略的综述。此连载将包括以下内容：甲基化DNA结合蛋白MECP2[methyl CpG binding protein 2 (Rett syndrome)]的神秘使命、突触粘联蛋白neuroligin-neurexin家族走向自闭症研究前沿、泛肽化关键蛋白UBE3A(ubiquitin protein ligase E3A)与天使综合征(Angelman syndrome)和自闭症，以及用果蝇(Drosophila)模式生物研究neuroligin-neurexin家族蛋白的新功能。此连载由4篇通俗综述组成，均由国内活跃在自闭症研究前沿的青年科研工作者撰写，希望为自闭症的基础及临床研究提供有用信息。
一 新蛋白的发现
1992年，英国爱丁堡大学研究DNA甲基化的生物化学家Adrian Bird博士发现了一个新的能与甲基化DNA相结合的蛋白质，这是他发现的第二个能与甲基化DNA结合的蛋白质，于是将其命名为methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2)[2]【Lewis et al. 1992】。他在找到这个蛋白质的时候，发现其功能很强大，能与单个被甲基化的DNA碱基相互作用，不过他不曾想到的是大约7年以后，这个神奇的蛋白质居然会被发现与一种严重的遗传病有关，而且会成为人们理解自闭症遗传基础的一把重要的钥匙。
【Adrian Bird 图片出处：www.realscience.org.uk】
说起Bird博士，那可是师出名门，他在20世纪70年代末刚刚走入科学殿堂的时候，就跟着生物化学与分子生物学界家喻户晓的Edwin Southern博士做研究。Southern？难道是？不错，就是Southern blot（南方墨点法，又称Southern印迹法，一种普及的分子生物学技术，功能在于经由胶体电泳分离的样品中，含有特定序列的去氧核糖核酸片段——资料出处：维基百科，编辑注）的发明者。说起Southern blot在生物学界可是无人不知无人不晓，这种用来检测DNA的经典方法就是Bird博士的老师Southern博士于70年代发明的[3]【Southern 1975 】。Southern博士发明的DNA杂交技术以及之后在玻璃介质上原位进行DNA合成的方法都为90年代蓬勃发展的DNA芯片技术奠定了重要基础，这些技术目前都已经成为分子生物学工作者必备的利器。Southern博士已经获得了美国著名的Lasker奖，笔者相信Southern博士以后很有可能赢得诺贝尔奖金。
与功成名就的Southern博士比起来，Bird博士当时还只是毛头小子，但他在DNA甲基化修饰领域的一系列研究却已为人瞩目。Bird博士领导的研究组找到了一系列与甲基化DNA相结合的蛋白质。DNA的CpG岛可以被甲基化修饰已经早为人知，但是功能不甚了解。研究者们猜测DNA的甲基化是关闭基因表达的开关，但直到20世纪90年代初，还没有直接证据。Bird博士领导的研究组于1997、1998年接连发表两篇重要文章，发现MeCP2通过与组蛋白去乙酰化复合物直接作用而抑制基因的表达[4,5]【Nan et al. 1997; Nan et al. 1998】。原来如此！DNA本身的甲基化只是一个信号，真正行使抑制基因表达功能的是甲基化DNA蛋白招募来的组蛋白去乙酰化复合物(histone deacetylase complex)。基因启动子位置的组蛋白被去乙酰化作用后使染色体处在紧缩的状态，从而阻碍转录起始复合物的靠近，进而关闭基因的表达。Bird博士的研究组在接下来的工作中发现了一系列的甲基化DNA结合蛋白，将其命名为MBD1~MBD4[6]【Hendrich 1998】。
关于甲基化DNA结合蛋白的分子生物学，好像已经真相大白了。没想到真正的暴风雨在1999年才真正到来，从此之后，甲基化DNA结合蛋白MeCP2一下子成为科学研究和医学界的热点和宠儿，从看似平常的甲基化DNA结合蛋白一跃成为大脑中具有神秘使命的关键因子。
二 Rett综合征——战火中走出的女科学家
1975年，刚走入贝鲁特美国大学(The American University of Beirut)医学院就读的年轻的Huda Zoghbi立志成为一名出色的女医生，无奈黎巴嫩内战的战火慢慢蔓延开来。在医学院的第一年，Zoghbi只能躲在女厕所旁边的防空洞里面过夜。那个时候她和同伴目睹了炸弹时常落在校园里，度过了第一个学年后，她还想回去继续学习，但是因为弟弟被弹片击中而受伤，他父母决定送姐弟俩去美国继续学业。Zoghbi得以在美国田纳西州Meharry医学院继续完成医学学位，但是独在异乡的日子很难熬，还好当初在大学里一起躲避炮弹的男同学一直给她写信，这个男生在一年后也来到美国，有情人终成眷属。
Zoghbi博士 图片出处：nihrecord.od.nih.gov/
这段浪漫故事发生在Zoghbi博士成为科学家之前。得到医学学位之后，Zoghbi博士成为了一名神经科医生，她陆续接触到很多罹患罕见遗传病的孩子。在Zoghbi博士做住院医生的第二年，她遇到一个奇怪的病人，这个小女孩在2岁之前过着正常的生活，但是突然之间生长发育出现了停滞，而且刚刚学会的咿呀学语也都不会了，并有癫痫样症状，双手不自主的搓动，呈现出刻板的行为，眼光也不会随着医生的主动引导而变化，呈现出类似自闭症的症状。
这是Zoghbi博士第一次接触到Rett综合征(Rett syndrome)。这是一种罕见的遗传疾病，大多在女孩上发现，发病率约在一万到一万五千分之一，因此寻找完整的家系找到致病基因非常困难。在历经了十几年的努力后，1999年，Zoghbi博士领导的研究组终于找到了这个严重发育性疾病的致病基因—MeCP2[7]【Amir 1999】！
因为Rett综合征患儿的刻板行为与避免与他人眼神交流的沟通缺陷症状，被神经病学家归类为自闭症谱系障碍(Autism spectrum disorders)。因为MeCP2基因位于X染色体上，所以此基因的缺失突变对男性影响很大，往往无法出生，而携带突变的女性患儿可以出生，但是在发育早期(1~3岁)时就会开始发病，导致运动能力的缺失而往往只能在轮椅上度过一生，同时没有语言能力、认知能力严重受损、生活完全不能自理，对病患及家庭都造成很大痛苦。
Rett综合征与我们通常说的典型自闭症还有不同，虽然伴有刻板性行为和避免目光交流等症状，但典型的自闭症患者的生长发育所受影响往往不明显。国际精神病学界在最新版的自闭症诊断标准中不再将瑞特综合征继续作为自闭症谱系障碍进行诊断。但是MeCP2这个神秘的基因究竟与自闭症有什么关系呢？
Zoghbi 博士经过多年研究，在自闭症患者人群中发现，MeCP2基因发生的拷贝数增多可以在男性中导致严重的自闭症[8]【Ramocki 2009】。这个发现再一次告诉我们MeCP2基因在大脑神经发育过程中扮演着重要角色。因为MeCP2基因位于X染色体上，所以男性只携带一份MeCP2基因，如果发生缺失功能的突变，则不能够出生；如果发生染色体区段重复导致的MeCP2拷贝数加倍则整体的MeCP2基因含量上升了100%，因此大脑不能承受过多MeCP2蛋白，而发生功能性的紊乱出现严重的自闭症。
而女性携带两份MeCP2基因，在机体中还有随机的X染色体失活(X chromosome inactivation)现象，因此，如果MeCP2基因发生加倍，在机体中还会被随机的失活一份，加倍拷贝可能因随机失活而减小对机体的伤害。
总之，MeCP2基因对生物体来说，少了不行，多了也不行。过犹不及的MeCP2基因，它的编码蛋白无非与甲基化DNA结合而已，究竟有什么重要功能，能对神经系统的发育与正常功能造成如此大的影响呢？为了解答这个问题，必须由生物化学家与分子生物学家进行详尽的机制研究，接下来，是生物化学家们再立奇功的时候了。
三 生物化学家再立奇功
2003年的哈佛大学神经生物学系，Michael E. Greenberg博士领导的研究组一直研究在兴奋的神经细胞中基因被诱导表达的分子机制。Greenberg博士因为在20世纪80年代首次发现神经递质乙酰胆碱(acetylcholine)可以诱导极刻早期基因(immediate early gene)c-fos的快速表达而闻名遐迩[9]【Greenberg 1986】。接下来的系列研究发现一些对神经系统有重要功能的基因，例如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表达也是可以被神经元的去极化兴奋所诱导表达的[10]【Tao 1998】。
陈文博士(音译)是在Greenberg博士研究组的一名博士后，正在研究BDNF基因被神经电信号诱导表达的分子机制。那天心血来潮，她突然想起楼上实验室有个熟识的朋友正在研究一种好玩的甲基化DNA结合蛋白，好像名字叫MeCP2，于是就跑到楼上去把MeCP2的抗体拿过来，做了一个简单的实验，看看MeCP2蛋白会不会结合在BDNF基因的启动子上。
做个好玩的科学实验需要理由么？需要么？不需要么？很多时候，当我们在描述许多科学发现的时候，我们需要一个rationale，所谓为什么要做这个实验。多年后，Greenberg博士在学术报告中说起这无厘头的第一个实验的时候，他自己承认，这个实验是没有缘由的。很多重要的科学发现就是在这样的偶然中诞生了。但是我们不可否认，重要的科学发现有时也需要天马行空、奇思妙想的激情！
陈文博士的朋友在著名的分子遗传学家Rudolf Jaenisch博士实验室工作。Jaenisch博士是著名的表观遗传学家，对DNA甲基化机制有很多系统性的研究。在1999年Zoghbi博士发现MeCP2这种甲基化DNA结合蛋白的编码基因突变是导致Rett综合征的原因之后，Jaenisch博士实验室就开展了关于MeCP2的研究。2001年Jaenisch博士与Bird博士同时在Nature Genetics杂志上发表了MeCP2基因敲除小鼠的报道。他们发现在MeCP2基因敲除小鼠中也出现了与Rett综合征病人类似的症状，例如运动能力缺损、频发癫痫等，因此MeCP2基因敲除小鼠成为一种非常重要的研究Rett综合征的小鼠模型[11,12]【Chen 2001, Guy 2001】Jaenisch博士领导的研究组因此拥有很多与MeCP2有关的实验试剂，例如针对MeCP2的抗体以及MeCP2基因敲除小鼠等。
陈文博士闲来无事做了这个实验以后，结果却给了她很大的惊喜！她发现MeCP2蛋白居然与BDNF基因的启动子有很强的相互作用，难道BDNF基因的表达是被DNA甲基化调控的么？接下来，她发现了在神经细胞中，BDNF基因的启动子的甲基化水平是可以被神经电活动快速调控的。DNA甲基化水平的变化往往非常缓慢，需要数十个小时甚至更长的时间，而在神经系统中发现的DNA甲基化水平快速变化则提示相应的DNA甲基化酶与去甲基化酶系统在神经系统中有独特的调控机制[13,14]【Chen 2003，Martinowich 2003】。进一步研究还发现MeCP2可以调控BDNF这种重要神经营养因子的表达，于是研究者们进而提出，Rett综合征的发病原因是否是因为BDNF的表达失调呢？这些研究为MeCP2、Rett综合征以及自闭症谱系障碍的机制研究提供了重要的线索。
四 逆转基因决定的命运
在对MeCP2影响神经系统发育与功能的研究如火如荼进行的时候，罹患Rett综合征的小女孩和她们的家长们还在无助地寻找有可能帮助她们的灵丹妙药。无奈Rett综合征具备一些独特的特征，比如并不是由于神经细胞凋亡而导致的神经退行性疾病，因此研究者根据以往的经验推测是因为MeCP2基因的突变而导致了神经系统发育过程的功能失调。神经系统的发育速度是逐渐放慢的，换句话说，等大脑逐渐成熟之后，所谓的发育过程就会停止。那么可能是在发育早期被突变的MeCP2破坏的大脑结构，是否能在大脑发育过程已经基本完成的时候被修复呢？
面对这无数Rett综合征患者和她们父母无助的眼光，Bird博士领导的研究组开始了这样一个开创性的实验[15]【Guy 2007】。研究者首先在小鼠的MeCP2基因前面装上了一个开关，用于关闭MeCP2基因的表达，但是这个开关可以被药物在需要的时候打开。这个小鼠刚出生的时候MeCP2基因是被关闭的，于是开始表现出一系列的疾病表型，比如癫痫、行动困难及容易死亡等等。
接下来，Bird博士研究组的Guy博士开始了一系列细致的工作。首先，Guy博士一下子大剂量地加入了能打开MeCP2基因表达开关的药物。在缺失MeCP2基因的大脑中突然打开内源性的MeCP2，导致MeCP2蛋白的快速累积，没想到导致的结果却是灾难性的，小鼠无法承受突如其来的MeCP2蛋白，生长发育受到严重影响，接下来居然发生了死亡。这好像又是MeCP2蛋白过犹不及的魔咒。Guy博士于是更换方法，用小剂量的药物一点一点地打开被关闭的MeCP2基因。在经过了数年的反复实验，终于到了见证奇迹的时刻！
这些由于缺失MeCP2基因，已经表现出严重症状，步履蹒跚，眼看就要走到生命尽头的小鼠，当它们大脑中的MeCP2基因一点一点被打开后，这些严重的症状居然都成功地得到了逆转！这些小鼠在大脑中的MeCP2水平缓慢提升之后，一点一点地被治愈了！原来的癫痫、行动症状都消失了，而且大脑海马中的神经可塑性也得到了恢复。
这个实验第一次证明，已经发育成熟的大脑仍然具备很大的潜能。丧失MeCP2的大脑，发育会出现各种缺陷。但在整个机体已经成年之后，再给予缺失的关键蛋白，大脑中错综复杂的受损神经环路仍然可以恢复正常功能。这个实验也为Rett综合征的治疗打开了一扇崭新的大门，同时也提示，因为基因突变而导致疾病的其他自闭症谱系障碍，也许都可以通过适量的基因治疗而重新获得健康。
五 结束语
世界各国对自闭症谱系障碍的研究正在全面展开，遗传学家用最先进的测序技术继续寻找与自闭症有关的基因，分子生物学家与生物化学家发现多年前曾经研究过的蛋白质往往在神经系统里具有重要的功能，进而投身神经生物学研究领域。同时，我们仍然期待从基础研究到临床研究的转化研究可以为自闭症研究从准确的科学诊断到最终治疗贡献力量。笔者认为，对于自闭症这样一种复杂的神经系统疾病的研究，必须是多学科交叉合作才能取得实质性进展的，而发展历史较长的生物化学学科在对疾病基因的研究中扮演者非常重要的角色，接下来本系列要谈到的其他几个在自闭症中有重要功能的基因蛋白，其实最早都是被生物化学家发现的。因此笔者非常希望生物化学在自闭症研究这样的新兴领域中老树开新花，在二十一世纪的神经科学研究中焕发出耀眼的光芒！
参考文献
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[4] Nan X, Campoy FJ, Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell, 1997, 88: 471-481
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[15] Guy?J, Gan J, Selfridge J, et al. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science, 2007, 315: 1143-1147
关于本文
本文已发表于《生命的化学》